Kvalitativna detekcija Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium metodom real-time PCR

Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium nalaze se među prvih 5 svjetskih serotipova odgovornih za ljudske infekcije.  

Što je Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium?

Sukladno Uredbi Komisije (EZ) br. 2073/2005 o mikrobiološkim kriterijima za hranu propisano je da se u svježem mesu peradi dobivenom od rasplodnih jata vrste Gallus gallus, konzumnih nesilica, tovnih pilića te jata rasplodnih i tovnih pura te trupova peradi, tovnih pilića i pura provodi ispitivanje kako bi se utvrdila odsutnost navedenih serotipova. 

U novije vrijeme provode se brze metode ispitivanja koje su znatno kraćeg trajanja od klasičnih kultivacijskih metoda čime se ubrzava ispitivanje i dobivanje jednako pouzdanih rezultata.  

Koristeći specifične primere u lančanoj reakciji polimeraze u stvarnom vremenu pomoću PCR instrumenta i potrebnih pratećih reagensa umnožavaju se sekvence DNA specifične za Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium. PCR instrument detektira te umnožene fragmente kroz fluorescenciju izazvanu cijepanjem hibridizirane probe zbog 5̛ - nukleazne aktivnosti Taq DNA polimeraze.  

Proba je na 5̛ - kraju označena s reporterskim fluoroforom („reporter“), a na 3̛ - kraju s prigušivačem („quencher“).  

Za vrijeme faze produživanja tijekom svakog ciklusa, proba hibridizira internu sekvencu amplifikacije koja se cijepa 5̛ nukleaznom aktivnosti Taq DNA polimeraze.  

Ovo cijepanje probe razdvaja signal reportera od signala prigušivača, povećavajući reporterski signal. PCR instrument mjeri emitiranu fluorescenciju reportera. 

Laboratorij za molekularna ispitivanja je akreditiran za ispitivanje hrane, okolišnih uzoraka i bakterijskih kultura. Postupak se sastoji od pripreme inicijalne suspenzije gdje se određenoj količini uzorka dodaje puferirana peptonska voda, a potom slijedi inkubacija tijekom 18 sati pa izolacija DNA. Ukoliko imamo potvrđene kolonije Salmonella spp. na hranjivoj podlozi potrebno je napraviti samo postupak izolacije DNA.  

Nakon toga slijedi završna priprema PCR master mix, standarda, stavljanje stripova u uređaj te u odgovarajućem programu postavljanje potrebnih parametara i pokretanje rada instrumenta.  

Kroz 2 sata se očitavaju rezultati i izražavaju kao pozitivan ukoliko je produkt detektiran, a sve kontrole daju očekivane rezultate ili negativan ukoliko PCR produkt nije detektiran, a sve kontrole daju očekivane rezultate.